玉米赤霉烯酮檢測試劑盒 使用說明書 （酶聯(lián)免疫法） 1 原理及用途 本試劑盒采用間接競爭 ELISA 方法檢測谷物、飼料、食用 油、啤酒、醬油等樣本中的玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN） （又稱 F-2 毒素），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標板、辣根 酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑組成。檢測時，加入 標準品或樣本溶液，樣本中的玉米赤霉烯酮和酶標板上預(yù)包被 偶聯(lián)抗原競爭抗玉米赤霉烯酮抗體，加入酶標記物后，用 TMB 底物顯色，樣本吸光度值與其所含玉米赤霉烯酮含量成負相 關(guān)，與標準曲線比較即可得出樣本中玉米赤霉烯酮的殘留量。 2 技術(shù)指標 2.1 試劑盒靈敏度：0.3ppb(ng/ml) 2.2 反應(yīng)模式：25℃，30min～15min 2.3 檢測下限： 谷物及其食品原料…………………6ppb 飼料及飼料原料………………………18ppb 玉米皮、麥麩…………………………18ppb 2.4 交叉反應(yīng)率： 玉米赤霉烯酮……………………100% 玉米赤霉酮………………………13% 玉米赤霉醇………………………＜1% 2.5 樣本回收率： 谷物及其食品原料…………………90%±15% 飼料及飼料原料………………………80%±15% 玉米皮、麥麩…………………………80%±15% 3 試劑盒組成 酶標板……………………………96 孔 標準液（黑蓋）：各 1ml 0ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb、24.3ppb 酶標記物（紅蓋）…………………5.5ml 抗體工作液（藍蓋）………………5.5ml 底物液 A（白蓋）…………………6ml 底物液 B（黑蓋）……………………6ml 終止液（黃蓋）………………………6ml 20×濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml 說明書…………………………………1 份 蓋板膜…………………………………1 張 自封袋…………………………………1 個 4 需要的器材和試劑 4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質(zhì)器 、振蕩器、離心機、刻 度移液管、天平（感量 0.01g） 4.2 微量移液器：單道 20µl-200µl，100µl-1000µl、多道 300µl 4.3 試劑：甲醇、去離子水 5 樣本前處理 5.1 樣本處理前須知： 實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實 驗結(jié)果。 5.2 配液： 配液 1：樣本提取液 90%甲醇，即 V 甲醇:V 去離子水=9：1。 配液 2：工作洗滌液 將濃縮洗滌液 20 倍稀釋(1 份洗滌液加 19 份去離子水)。 5.3 樣本前處理步驟： 5.3.1 谷物（大米、玉米、小米等低脂含量）及其食品原料 1）稱取 2g 粉碎樣品于 50ml 離心管中，加 8ml 樣本提取液， 振蕩 5 分鐘，室溫 4000 轉(zhuǎn)/分離心 10 分鐘； 2）取 0.5ml 上清，加入 2ml 去離子水，混勻； 3）取 50μl 進行分析。 稀釋倍數(shù)：20 檢測下限：6ppb 5.3.2 飼料及飼料原料 1）稱取 2g 粉碎樣品于 50ml 離心管中，加 8ml 樣本提取液， 振蕩 5 分鐘，室溫 4000 轉(zhuǎn)/分離心 10 分鐘； 2）取 0.5ml 上清，加入 1ml 提取液，震蕩混勻； 3）取 0.5ml 混勻液體，加入 2ml 去離子水，混勻； 4）取 50μl 進行分析。 稀釋倍數(shù)：60 檢測下限：18ppb 5.3.3 玉米皮、麥麩等吸水性強的樣本 1）稱取 2g 粉碎樣品于 50ml 離心管中，加 24ml 樣本提取液， 振蕩 5 分鐘，室溫 4000 轉(zhuǎn)/分離心 10 分鐘； 2）取 0.5ml 上清，加入 2ml 去離子水，混勻； 3）取 50μl 進行分析。 樣本稀釋倍數(shù)：60 檢測下限：18ppb 注：由于毒素在樣本中的分布呈非均勻狀態(tài)，取樣時需多點取 樣充分混勻后再取 2g 進行試驗。 6 酶聯(lián)免疫試驗步驟 將所需試劑從 4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡 30min 以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解， 每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框 架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于 2-8℃。 6.1 編 號：將樣本和標準品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本 和標準品做 2 孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。 6.2 加樣反應(yīng)：加標準品或樣本 50µl/孔到各自的微孔中，然 后加酶標記物 50µl/孔，再加入 50µl/孔的抗體工作液，用蓋 板膜封板，輕輕振蕩 5 秒混勻，25℃反應(yīng) 30 分鐘。 6.3 洗 滌：小心揭開蓋板膜，甩去孔內(nèi)液體，每孔加 350ul 工作洗滌液，靜置 30 秒后棄去，重復(fù)洗滌 5 次，最后一次拍 干（用吸水紙拍干，拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺 破）。 6.4 顯 色：每孔加入底物液 A 50µl，再加底物液 B 50µl， 輕輕振蕩 5 秒混勻，25℃避光顯色 15 分鐘（若藍色過淺，可 適當(dāng)延長反應(yīng)時間）。產(chǎn)品縮寫：ZEN 貨號：RJ-P100055 版本：2022.1 2 6.5 終 止：每孔加入終止液 50µl，輕輕振蕩混勻，終止反 應(yīng)。6.6 測吸光值：用酶標儀于 450nm 處測定每孔吸光度值（建議 用雙波長 450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后 10 分鐘內(nèi)完成。 7 結(jié)果分析 7.1 百分吸光率的計算 標準液或樣本的百分吸光率等于標準液或樣本的百分吸 光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準液（0ppb）的吸光度 值，再乘以 100%，即 百分吸光度值（%）＝ A ×100% A0 A—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值 A0—0ppb 標準溶液的平均吸光度值 7.2 標準曲線的繪制與計算 以標準液百分吸光率為縱坐標，對應(yīng)的標準液濃度（ppb） 的對數(shù)為橫坐標，繪制標準液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分 吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃 度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。 若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的 準確、快速分析。（歡迎來電索取） 8 注意事項 8.1 室溫低于 25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致 所有標準的 OD 值偏低。 8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標準曲 線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行 下一步操作。 8.3 混合要均勻，洗板要，在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很 大程度上取決于洗板的一致性。 8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。 8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試 劑盒中的試劑。 8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0 標準的吸光 度值小于 0.5 個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。 8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。 9 貯藏及保存期 儲藏條件：試劑盒于 2-8℃保存，避免冷凍。 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為 1 年，生產(chǎn)日期見包裝盒。